Characterization of the genetic bases of codling moth resistance to (bio)insecticides for their high-throughput molecular detection in landscapes
Caractérisation des bases génétiques de la résistance du carpocapse des pommes aux (bio) insecticides pour leur détection moléculaire à haut débit dans les paysages
Résumé
The codling moth, moth, Cydia pomonella, is a major pest of apple and pear orchards worldwide. The intensive use of (bio)insecticides to control it has led to the evolution of a growing number of resistant phenotypes in natural populations. Various mechanisms at the origin of these phenotypes have already been identified: 'target site’ resistance (TSR), via genetic modifications to the molecular targets of insecticides, or 'non-target-site' resistance (NTSR), notably via an increase in detoxification, which leads to the degradation of insecticide molecules before they bind to their target. However, the molecular bases involved in these mechanisms have not been fully identified, particularly for NTSR, where they remain largely unknown. In this context, the main objective of this study is to identify the genetic basis of NTSR, and in particular detoxification, to different (bio)pesticides in C. pomonella. The second objective is to test whether these NTSR confer cross-resistance in populations resistant to several active substances (AS). The third, more applied, objective is to identify markers for diagnosing resistant phenotypes using molecular approaches. To meet these objectives, we used an experimental evolution approach combined with NGS sequencing, on a population characterised as resistant to different AS. Three insecticidal SAs were chosen for experimental evolution: chlorantraniliprole, deltamethrin and spinosad, to create three different lines by exerting differentiated selection pressures with the AS of interest. Finally, pooled RNA and DNA sequencing of the lines obtained was carried out to identify the genetic variations associated with resistant phenotypes. In the first part, the evolution of the phenotype of the different experimental lines was analysed using ingestion bioassays and enzyme activity measurements. In particular, we were able to observe that despite the selection pressures applied, the enzymatic activities of our lines were not significantly different from our sensitive reference strain. Secondly, using RNAseq analyses, we were able to identify genes with differential expression profiles according to the selection pressures of our lines. Among these genes, we looked for those known to be involved in RNLC and identified various enzymes involved in detoxification, in particular various multiple function oxidases (P450), and a glutathione-S-transferase (GST). Genes involved in the odour perception system and stress mechanisms, families not previously associated with insecticide resistance in C. pomonella, were also identified. The identification of polymorphisms variation in the transcripts illustrated the involvement of cuticular, transport and intermediary metabolism proteins, as well as various enzymes involved in the transfer of energy to detoxification enzymes. Finally, using DNAseq analysis, we searched the entire genome for signatures of selection and polymorphism variations. We compared sequencing coverage between resistant and susceptible populations to identify copy number variations (CNVs) in certain genes associated with resistance. To identify associations between polymorphisms and resistance, we combined a Bayesian approach with a filter approach based on changes in allele frequencies between generations and conditions. All of these analyses confirmed the role of various enzymes already known to be involved in detoxification mechanisms in our resistant phenotypes, but also highlighted the involvement of gene families that had not previously been described. In addition, we noticed that none of our results relating to detoxification in our transcriptomic and genomic analyses were common to our different lines. These results thus contribute to a better understanding of the complex mechanisms associated with insecticide resistance and provide a basis for the development of new resistance detection tools based on molecular approaches.
Le carpocapse des pommes, Cydia pomonella, est un ravageur majeur des vergers de pommiers et de poiriers dans le monde entier. L'utilisation intensive de (bio)insecticides pour leur contrôle a conduit à l’apparition d’un nombre croissant de phénotypes résistants au sein des populations naturelles. Différents mécanismes à l’origine de ces phénotypes ont déjà pu être identifiés : des résistances dites ‘liées à la cible’ (RLC), via des modifications génétiques des cibles moléculaires des insecticides ou des résistances ‘non liées à la cible’ (RNLC), via notamment une augmentation de la détoxication, qui entraîne une dégradation des molécules insecticides avant qu’elles ne se fixent sur leur cible. Cependant, les bases moléculaires impliquées dans ces mécanismes n’ont pas été totalement identifiées, notamment pour les RLNC, où elles restent encore pour la plupart méconnues. Dans ce contexte, l'objectif principal de cette étude est l'identification des bases génétiques des RNLC, et en particulier de la détoxication, à différents (bio)pesticides chez C. pomonella. Le second objectif est de tester si ces RNLC confèrent des résistances croisées dans des populations résistantes à plusieurs substances actives (SA). Le troisième objectif, plus appliqué, est d’identifier des marqueurs permettant un diagnostic des phénotypes résistants par des approches moléculaires. Pour répondre à ces objectifs, nous avons utilisé une approche d’évolution expérimentale combinée à un séquençage NGS, sur une population caractérisée comme résistante à différentes SA. Pour mener l’évolution expérimentale, trois SA insecticides ont été choisies : le chlorantraniliprole, la deltaméthrine et le spinosad, pour créer trois lignées différentes en exerçant des pressions de sélection différentiées avec les SA d'intérêt. Enfin, un séquençage en pool ARN et ADN des lignées obtenues a été effectué, afin d'identifier les variations génétiques associées aux phénotypes résistants. Dans une première partie, l’évolution du phénotype des différentes lignées expérimentales a été analysée par l’utilisation de bioessais par ingestion et par des mesures d’activités enzymatiques. Nous avons notamment pu constater que malgré les pressions de sélection exercées, les activités enzymatiques de nos lignées n’étaient pas significativement différentes de notre souche sensible de référence. Dans un second temps, via des analyses RNAseq, nous avons pu identifier des gènes présentant des profils d’expression différentielle selon les pressions de sélection de nos lignées. Nous avons recherché parmi ces gènes ceux connus pour être impliqués dans les RNLC, et avons identifié différentes enzymes impliquées dans la détoxication, notamment différentes monooxygénases à fonctions multiples (P450), et une glutathion-S-transférase (GST). Des gènes impliqués dans le système de perception d’odeurs et dans des mécanismes de stress, des familles n’ayant pas été associées à la résistance aux insecticides chez C. pomonella, ont également été identifiés. La recherche de polymorphismes dans les transcrits a également permis d’illustrer l’implication de protéines cuticulaires, de transport et du métabolisme intermédiaire, ainsi que différentes enzymes impliquées dans les transferts d’énergie aux enzymes de détoxication. Enfin, par l’analyse DNAseq, nous avons cherché sur l’ensemble du génome des signatures de sélection et de variations de polymorphisme. Nous avons comparé la couverture de séquençage entre populations résistantes et sensibles afin d'identifier des variations de nombre de copies (CNVs) de certains gènes associés à la résistance. Pour l’identification d’association entre polymorphisme et résistance nous avons combiné une approche bayésienne et une approche de filtres sur les changements de fréquences alléliques entre générations et conditions. L’ensemble de ces analyses a permis de confirmer le rôle de différentes enzymes déjà connues comme impliquées dans des mécanismes de détoxication dans nos phénotypes résistants, mais a également mis en lumière l’implication de familles de gènes qui n’avaient jusque-là pas été décrites. De plus, nous avons pu remarquer qu’aucun de nos résultats liés à la détoxication dans nos analyses transcriptomiques et génomiques n’étaient communs entre nos différentes lignées. Ces résultats contribuent ainsi à une meilleure compréhension des mécanismes complexes associés à la résistance aux insecticides et fournissent une base pour le développement de nouveaux outils de détection de la résistance, basés sur des approches moléculaires.
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